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DNA-Geschlechtsbestim-
mung aus Vogelfedern
DNA-geslachtsbepaling
uit vogelveren
Avian DNA sexing
DNA-Kønsbestemmelse
ved hjælp af fugle fjer
Определение пола птиц при
помощи анализа ДНК из перьев
IL DNA- la determinazione di
Sesso fuori di uccello di Cuscino
El Reconocimiento del
ADN de plumas de aves
Determinação do Sexo por análise
do DNA de penas de aves
Détermination du sexe par ADN
à partir de plumes d’oiseaux

Leitfaden zur Beprobung von Fischbeständen

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Organe/Organteile (Kieme und Niere) und/oder Blutproben (Gerinnungshemmer, z.B. Heparin) sind unter sterilen Kautelen zu entnehmen und in ein steriles Kunststoffröhrchen mit Transportmedium (z. B. Zellzuchtmedium mit 10-fachem Antibiotika- Zusatz) zu geben. Die Proben sind sofort auf unter 10 °C zu kühlen.
Für den Versand von Probenmaterial wird Isopropanol (100 %) empfohlen, Ethanol in jeglicher Konzentration scheint ungeeignet zu sein und kann nach einer Lagerungszeit der Proben von über 7 Tagen zu falsch-negativen Ergebnissen führen.

Probenbeschriftung
Die eingesandten Proben sollten vollständig mit Angaben zur Fischart, Herkunft, Größe und Fischhalter beschriftet werden, um eine eindeutige Zuordnung zu gewährleisten. Der Einsendetermin sollte mit der Untersuchungsstelle abgesprochen sein.

Probenvolumen (im Bezug zu biometrischen Anforderungen) (siehe Tab. im Anhang)
Prophylaktische Untersuchung auf KHV-I
Die Probengröße ist abhängig von der Krankheitshäufigkeit (Prävalenz). Die Prävalenz sagt aus, wie viele Fische einer Gruppe oder Population an einer bestimmten Krankheit, z. B. an KHV-I, erkrankt sind.
Ausgehend von einer Population von 500 Tieren sollten bei einer angenommenen 10%igen Krankheitshäufigkeit 28 Tiere bzw. bei angenommener 5%igen Krankheitshäufigkeit 56 Tiere untersucht werden um eine 95%ige Aussagesicherheit zu erhalten.
Für eine 99%ige Aussagesicherheit müssten bei gleichbleibender Population und Krankheitshäufigkeit (10% – 5 %) zwischen 42 und 83 Tiere getestet werden.
In Bezug auf sehr kleine Populationen sollte die Probenanzahl auf keinen Fall unter 10 Fischen liegen (siehe Tabellen im Anhang).
Aufgrund der Wertfrage der zu beprobenden Tiere ist eine Umsetzung in die Praxis nicht immer durchführbar – daher die Forderung nach der Entnahme von Bioptaten (Blut o. Kiemengewebe) bzw. dem Einsatz von Sentinelfischen (Pilotfischen).

Untersuchungsmethode
1. PCR-Methode
Die Methode der Wahl ist die molekularvirologische Untersuchung (Erbgutnachweis des Koi Herpesvirus) mittels der PCR-Technologie (Goldstandard). Im Rahmen der Umsetzung der Aquakulturrichtlinie 2006/88/EG ist die Methode der PCR-Diagnostik vorgeschrieben bzw. in der Tierseuchenverordnung neben der Virusanzucht als einzige zulässige Methode vorgegeben.

  1. akute Erkrankungen: Bei einem Verdacht auf eine akute KHV-Infektion können die Proben mittels der Standard PCR (Gilad, 2002) untersucht werden.
  2.  Carrierfische, latente KHV-Infektionen: Latent infizierte Tiere sollten mittels der sogenannten nested-PCR, der semi-nested-PCR oder der realtime-PCR untersucht werden. Alle drei Methoden zeichnen sich durch eine extrem hohe Sensitivität aus. Die Nachweisgrenze liegt hier bei 10fg DNA (0,000000000000010g DNA), dies entspricht ca. 5 Koi-Herpes Viren. Andere Methoden zum KHV-I Nachweis wie z.B. die Loopamp-Methode (Nachweisgrenze ca. 100-1000 Koi Herpes Viren) oder die Standard-PCR sind für die Analyse von Carrierfischen ungeeignet.

In unserem Labor können neben der Standard-PCR sowohl die nested PCR als auch die semi-nested PCR durchgeführt werden. Im Vergleich zur nested PCR wurde die semi-nested PCR speziell für den Routineeinsatz entwickelt. Die Durchführung der PCR findet hier in einem einzigen Reaktionsgefäß statt, wodurch mögliche Kontaminationen und daraus resultierende falsch positive Befunde minimiert werden.

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